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霉菌检测过程中几个关键问题探讨


霉菌广泛分布于土壤、水、空气等自然环境中。由于霉菌孢子可以较长时间存活于空气中,并通过空气传播给其他物质,因此无所不在,防不胜防,给人类的生活和健康带来很多危害。霉菌及霉菌毒素污染所造成的损失早已引起人们的高度重视,特别是食品卫生领域,近年来世界各国纷纷制订多种食品中毒菌及霉菌毒素的限量标准,同时加强对霉菌检测技术的研究,并不断提出新的见解,完善该项技术。


国家标准GB16740-2014中,所有的保健食品的霉菌指标。

自从1997年各级食品卫生检测机构都全面开展霉菌的检测工作。由于霉菌检测技术起步较晚,加上其生理和形态的多样化和复杂性,至今仍有不少基本的问题得不到很好的解决。近年来,这方面的研究进展很快,国内外不少学者提出了许多改进措施,为了更好地解决霉菌检测过程中遇见的各种问题,本文根据作者的实验观察,并结合国内外有关研究的最新进展,对霉菌检测过程中几个关键问题试作全面的探讨。


1、培养基的选择


培养基的选择应根据实验材料和检验目的来确定。目前国标方法中使用的培养基有:马铃薯葡萄糖琼脂(PDA),孟加拉培养基(RBC)、高盐察氏培养基(CAO),其中PDA和RBC适合于一般的霉菌和酵母菌生长,而CAO则适合于高渗性霉菌生长,酵母菌几乎不长。

培养基的选择应根据实验材料和检验目的来确定。目前国标方法中使用的培养基有:马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)、孟加拉培养基(RBC)、高盐察氏培养基(CAO),其中PDA和RBC适合于一般的霉菌和酵母菌生长,而CAO则适合于高渗性霉菌生长,酵母菌几乎不长。


在日常检测中我们发现,有些常见的耐高渗性霉菌,如局限曲霉、谢瓦曲霉、赤曲霉、Wallemia等在PDA、RBC上生长非常缓慢或不长,而这些菌在高渗培养基如M40Y、DG18上则正常生长。孢子、形态特征发育良好,而且酵母菌也能在M40Y、DG18上生长,因此,若能同时采用PDA和M40Y(或DG18)分离培养各类样品中的霉菌,将能更全面地反映出污染霉菌的菌相。特别是对干燥食品、高糖食品、淹渍食品等,更有必要同时采用M40Y或DG18。


由于霉菌中很多种类不会产生有毒的霉菌毒素,危害较小,而有的菌株即使污染数量不多,但其产生的霉菌毒素却危害较大,因此仅作霉菌计数并不能全面反映其危害程度,重要的是要知道污染菌的菌相,才能更好地判断被污染食品的安全程度。


为此,国外有些研究者设计出各类选择性培养基,可以识别产毒的霉菌。如AFPA培养基(配方:酵母提取汁20g,蛋白胨10g,柠檬酸铁铵0.5g,0.2%二氯硝基苯胺1.0mL,琼脂15g,蒸馏水1000mL,PH5.6)用于分离黄曲霉毒素产生菌高污染率的食品。产黄曲霉毒素的菌株黄曲霉和寄生曲霉在AFPA上30℃培养2~3天就形成背面有亮橙黄色的特征性菌落,非常容易识别。有人利用该培养基分离黄曲霉高污染食品花生、玉米等,取得了满意的结果。因此,针对不同样品,有目的地设计出相应的选择性培养基,以筛选污染菌中的危险菌群,将是一个值得探索的方向。


二、接种方式

接种方式主要有倾注法和涂布法两种。目前国际方法中采用倾注法,但近来国际上有不少学者认为霉菌计数采用涂布法更合适。


Beuchat和Matsuda等人分别对这两种方法作了大量比较试验后发现,对霉菌计数来说,涂抹法有以下几方面优越于倾注法:①培养出的霉菌菌落数较多;②培养所需的时间较短;③霉菌孢子、菌落形态特征发育完全,便于鉴定。这是因为绝大多数霉菌是好氧的,在培养基表面生长快,发育好,而混在培养基中发育就受影响,而且在培养基倾注时霉菌孢子易受热损伤。我们在自己的实验室也做了类似的比较试验,通过对30种常见霉菌的试验证实了上述的结论。因此,我们认为,霉菌计数采用涂布法既准确又省时,值得推广。


三、培养温度

经对多种常见霉菌的最适生长温度作了调查发现,大部分菌种的最适温度为25~30℃。但一些产曲霉毒素的菌株或动物致病菌则需要更高的温度,如黄曲霉35℃、构巢曲霉33℃、烟曲霉37℃、小孢子菌35℃。因此,培养温度也应根据培养目的而定,一般情况下都采用25~28℃培养,若有特殊培养目的,则应适当调节培养温度。


四、培养时间

我们对30种常见霉菌的生长速度作了调查,正常培养条件下,培养3~4天的菌落数与5~7天的基本相同,但菌种的特征不明显,因此,如果只要作霉菌计数,培养3~4天已基本达到目的,但如果还要进一步分类鉴定,则需要培养更长的时间(7~14天)。必须特别注意的是,有几类生长特别快、菌丝很多的菌,则必需在48小时以内计数,否则菌丝就会覆盖整个平皿,无法准确计数。这类菌主要有:毛霉、根霉、犁头霉、共头霉、木霉等湿度较大的样品,这类菌污染较多,检测这类样品,应提早观察记录。


五、最适计数范围

霉菌菌落由孢子和菌丝组成,相当扩散,在直径9cm的平皿里,菌落数稍多就相互交叉重叠,影响计数,但数量太少又会产生较大的误差,因此选择适当的稀释度计数是保证结果准确的关键环节之一。


我们对这方面作了一些观察研究,首先是将实验菌株的斜面培养物制成含有约106个/ml的孢子悬液,并用血球计数器在显微镜下准确计数,然后将孢子悬液作10-1~10-6倍稀释,吸取不同稀释度的稀释液接种于PDA,25℃培养5天后计数。30种常见霉菌的两种不同计数方法所得结果比较显示,大部分菌株每平板含有10~50个菌落的稀释度时的计数与显微镜计数结果最接近;有近一半的菌株,每个平板含50~100个菌落已较难计数,而大部分菌株,超过100个/平皿或小于10个/平皿的计数结果就与显微计数结果存在较大差别,因此,应尽量选择10~50个/平皿的稀释度进行霉菌计数。


而对上述提及的菌丝很丰富、菌落特别扩散的毛霉、根霉、犁头霉等菌株,则应在更少的范围内计数(30个/平皿以内)。为控制霉菌的生长速度和菌落的生长范围,可在培养基中添加少量抗生素,如氯霉素(50~100mg/L),金霉素(20~100mg/L),庆大霉素(50mg/L),土霉素(100mg/L)等。


六、霉菌检测过程中应特别注意的事项


1、由于霉菌检测所需的时间较长,中间又需要多次观察,因此实验前一定要作好实验计划,明确观察记录的时间。


2、霉菌孢子通过空气传播,所以实验时应保持实验室平静,减少空气流通;操作时手脚要快,动作要轻,特别是培养过程中,如果观察时动作过大,早期生长出的霉菌孢子就会在培养基内扩散,形成新的菌落,导致结果不准确。


3、实验前应认真做好全面的消毒工作,包括操作人员手指、实验室空间、实验台等,实验后应第一时间将有霉菌的培养物高压灭菌,防止进一步扩散。


4、对使用的菌株的生理、生态、形态、毒理、致病性必需有充分的了解,并作好相应的防扩措施,防止污染其它物品。

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