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大肠埃希菌O157的ISO方法解读


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导    读

大肠埃希菌O157作为食品致病菌,早就引起人类的注意。2001年,ISO发布了ISO 16654:2001食品和动物饲料微生物学—大肠埃希菌O157检测的水平方法,对食品和饲料中的E.coli O157检测,给出了标准方法。


 

O157是E.coli的血清型。我国标准要求在牛肉制品和生食果蔬制品中不得检出。在ISO 16654:2001中,E.coli O157的检测分为四步:

 

检测步骤

1)增菌。采用含新生霉素的改良型TSB肉汤,41.5℃孵育6h,再紧接着孵育12-18h;

2)分离和富集。需要采用针对O157的抗体包被的免疫磁珠;

3)检出:采用CT-SMAC平板和另一款原理不同的选择性分离琼脂

4)验证:对CT-SMAC平板上的山梨醇阴性菌落和第二款选择性分离琼脂上的E.coli O157典型菌落,通过吲哚试验和E.coli O157抗血清的凝集试验进行验证。

 

增菌阶段

增菌阶段,ISO推荐用Modified tryptone soya broth,即改良型TSB肉汤,对此,HIMEDIA生产有Soyabean Bile Broth Base(货号M1286)和新生霉素添加剂(货号FD290),配方和ISO推荐的改良型TSB肉汤完全一致,可以采用。

 

培养基

对于CT-SMAC琼脂,HIMEDIA也生产有相应培养基(货号M1340,加添加剂,货号为FD147),培养结果见下图。O157为无色菌落。但不排除假阳性,如假单胞菌在此培养基中也可产生无色菌落。此时可进行氧化酶试验,在5-10秒内观察结果。假单胞菌为阳性,而O157为阴性。

 

同时,ISO 16654:2001也指出,存在山梨醇阳性的E.coli O157不会被CT-SMAC平板检测到。因此推荐同时使用另外一款选择分离培养基。此时可考虑HIMEDIA的另外一款O157选择性琼脂(显色培养基),货号为MV1575A,品名为HiCrome™ EC O157:H7 Selective Agar Base,Modified,配合添加剂(货号FD187)一起使用。其检测效果见下图。E.coli O157:H7能旺盛生长,菌落呈深紫色,而普通E.coli呈蓝绿色。

 

培养基添加剂中的亚碲酸钾能抑制气单胞菌和普罗威登菌生长,新生霉素抑制革兰阳性菌,月桂基硫酸钠抑制伴随的革兰阳性菌群。

 

在验证阶段,ISO也提示,发现存在吲哚阴性的突变菌。因此,也可以考虑用qPCR或多种生化鉴定的方式进行验证。

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